1.由于基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)之后要一段時(shí)間才能表達(dá)出蛋白質(zhì)。所以細(xì)胞株篩選時(shí)不能太早;但是也不能太晚，因?yàn)檗D(zhuǎn)染了外源基因的細(xì)胞代謝負(fù)荷較大，增值較慢，時(shí)間長了就會被沒有外源基因轉(zhuǎn)入的細(xì)胞所淹沒，終導(dǎo)致篩選不出陽性克隆，一般要在轉(zhuǎn)染24小時(shí)之后才開始加篩選。隨著細(xì)胞的代謝，濃度和活性都會下降，所以每3-5天都要更換一次篩選液。

　　2.加抗生素的時(shí)機(jī)，主要是考慮插入到細(xì)胞基因組的抗性基因是否已經(jīng)得到表達(dá)。一般是轉(zhuǎn)染48小時(shí)后加入抗生素。挑出單克隆后就可以用維持濃度，一般是穩(wěn)定細(xì)胞株篩選濃度的1/2。

　　關(guān)于維持濃度，有人說細(xì)胞會出現(xiàn)對抗生素的抗性，應(yīng)不斷提高其濃度。而且如果要挑選幾個(gè)陽性克隆中較高表達(dá)的克隆的話，可以調(diào)整抗生素的濃度。當(dāng)然，抗性基因高表達(dá)，目的基因不一定就跟著高表達(dá)。

　　此外，也需穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建培養(yǎng)液：

　　加藥篩選穩(wěn)定細(xì)胞株約6天左右，細(xì)胞會大量死亡，孔中只剩下的細(xì)胞*。這時(shí)會出現(xiàn)：

　　1.死亡的細(xì)胞會裂解釋放出有害物質(zhì)，導(dǎo)致那些有表達(dá)陽性細(xì)胞死亡，即非選擇性死亡，因此要及時(shí)換液。

　　2.孔中細(xì)胞數(shù)目很少，細(xì)胞之間的信號會變得很弱，也會導(dǎo)致陽性細(xì)胞的狀態(tài)不佳甚至死亡。這個(gè)時(shí)候需要一種特殊的培養(yǎng)液，再轉(zhuǎn)染后篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株過程中就可以應(yīng)用這種培養(yǎng)基。

　　3.適當(dāng)增加血清濃度。

>> 返回首頁